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　　鸡新城疫(鸡瘟)是鸡的一种烈性传染病，是由鸡新城疫病毒引起的一种急性高度传染性疾病。免疫预防是重要的防治手段，但影响免疫效果的因素有很多，诸如疫苗的质量、其他疫病的影响、强毒感染和变异株出现、免疫时间和免疫程序不当、鸡场环境卫生较差等。尤其是疫苗的保存温度对疫苗的效价影响最大。为此，大家对鸡新城疫疫苗设置不同温度刺激半小时稀释后免疫，以期找出解决影响免疫效果因素的方法和为疫苗合适的保存温度提供佐证材料。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 鸡新城疫(ND)冻干苗

　　来源于遵义市动物疫病控制中心。

　　1.1.2 试验鸡群

　　来源于遵义市红花岗区深溪、南关两个镇蛋鸡、肉鸡6户养殖大户，共计6000羽。

　　1.1.3 主要试剂

　　柠檬酸三钠、重铬酸钾、硫酸、0.9% 生理盐水、PBS液。

　　1.1.4 主要仪器与设备

　　96孔V型微量血凝板、单道和八道微量精密移液器、加样槽、吸嘴、微型振荡器、离心机、恒温箱。

　　1.2 试验时间与地点

　　2009年12月，在深溪、南关两镇选定了蛋鸡、肉鸡养殖各3户进行鸡群免疫。实验室工作于2011年8～12月在红花岗区农牧局动物疾病控制中心实验室进行。

　　1.3 影响疫苗免疫效果因素分析

　　1.3.1 是疫苗检查不严影响免疫效果

　　(1)瓶盖检查。检查瓶盖是否松动、脱落。瓶盖松动、脱落的疫苗因其密闭保存条件改变会使疫苗的抗原性(免疫原性)降低进而导致疫苗的效价降低、失效甚至产生副作用。

　　(2)标签检查。检查标签上的生产批文批号、生产日期、疫苗性状、保存条件、保存时间、使用剂量。没有取得生产批文批号的疫苗质量不可靠;生产日期和保存时间的检查主要看疫苗是否超过保存期，超过保存期的疫苗效抗原性(免疫原性)降低或消失，进而导致疫苗的效价降低、效价差，甚至失效;保存条件是否与标签上规定的条件一致，不符合标签规定保存条件保存的疫苗，疫苗的抗原性(免疫原性)降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.3.2 疫苗保存不当影响免疫效果

　　(1)保存温度不当。保存温度过高要或过低均会使疫苗的抗原性(免疫原性)降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　(2)保存避光不当。疫苗保存需要避光保存，如果避光条件不好也会使疫苗的抗原性(免疫原性)降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.3.3 疫苗使用操作不当影响免疫效果

　　(1)疫苗稀释不当。疫苗稀释不当有几种情况：不用规定的稀释液稀释疫苗;不按规定的稀释剂量稀释疫苗;稀释液与疫苗温差太大，会使疫苗的抗原性(免疫原性)降低或消失。

　　(2)疫苗使用不当。疫苗使用不当有几种情况：不按规定的使用方法使用;不按规定的使用剂量使用;使用器械、注射部位消毒不严。

　　(3)使用过程中保管不当。疫苗在稀释后使用过程中因保管不当，使稀释后的疫苗长时间置于强光或高温环境下会使疫苗的抗原性(免疫原性)降低或消失，进而导致疫苗的效价降低甚至失效。

　　1.4 试验方法

　　1.4.1 试验分组

　　将鸡新城疫(ND)疫苗从低温冰箱拿出后，分别在15～60℃(以5℃为梯度)恒温条件下保存30min后稀释进行免疫，从低温冰箱拿出后马上稀释免疫，并设空白对照组。试验总共12组。

　　1.4.2 1%红细胞悬液制备[5， 6]

　　由健康鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内(按抗凝剂：全血=1：2的比例)，迅速混匀。在离心机中以3000转/min离心5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水，慢慢混合均匀，再在离心机中3000转/min离心5min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心4～5次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4℃冰箱中可保存2～3天。使用时用1ml吸管汲取0.1ml红细胞泥，然后加入9.9ml的生理盐水，此即1%红细胞悬液。现用现配。

　　1.4.3 血清制备

　　每只鸡翅静脉采血0.5～1ml，静置待血清析出后或离心备用。

　　1.4.4 血凝(HA)试验[7，8～15]

　　①先用微量移液器向96孔V型反应板的每孔加生理盐水25μl;

　　②用微量移液器汲取待测抗原25μl于第一孔中并抽吸6次混合，后吸出25μl至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，弃去25μl;

　　③微量移液器再汲取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μl;

　　④置于微量振荡器上振荡1min后室温(18～22℃)静置30min观察结果;

　　⑤将反应板倾斜成45°，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。即沉淀的前一孔即为该抗原的效价。

　　⑥4单位抗原校正，按逐级稀释的方法将抗原作相应稀释后的HA试验，当从第五孔开始为完全沉淀，所以表明所配4单位抗原准确。

　　1.4.5 血凝抑制(HI)试验

　　每排孔检查1份血清。步骤如下：

　　①微量移液器先加25μl生理盐水于各孔中;

　　②用微量移液器汲取待检血清25μl置于第1孔中，然后倍比稀释至第11孔，弃去25μl，最后一孔不稀释，为红细胞对照;